循环miRNA作为冠脉不稳定斑块生物标志物及其机制的研究

【摘要】背景：冠心病是目前世界最常见死因之一,而冠脉中不稳定性斑块的存在是导致急性冠脉事件的主要病理学基础,因此早期识别不稳定斑块对于预测和干预血栓形成,对于降低心血管事件的发生率和死亡率具有十分重要的意义。但是目前尚无理想的不稳定斑块识别标志物,因此发展无创性的、易于推广的检查方法,探讨不稳定斑块的破裂机制具有重要意义。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的进化高度保守的单链非编码小RNA,循环miRNA是指血浆或血清中游离的miRNA,具有稳定、序列进化上高度保守、组织或病理特异性表达、检测灵敏等优点,逐渐作为疾病无创诊断和预后的理想生物标志物。但关于冠脉不稳定斑块循环miRNA标志物的研究尚属空白,在引发易损斑块破裂这一环节上,miRNA扮演什么角色却不清楚。因此,寻找能够特异性地出现在外周血中的miRNA不仅有望对斑块不稳定性作出更为早期和准确的预测,而且将为动脉粥样硬化的治疗和预防提供新的模式和靶点。目的：(1)明确在不稳定斑块携带者外周血中含量存在差异的miRNA,探讨利用其含量变化识别不稳定斑块的可行性,研究不稳定斑块相关的miRNA标志物。(2)明确不稳定斑块相关mniRNA直接作用的靶基因和与斑块蛋白质标志物的相关性,初步探讨miRNA在斑块破裂中作用的分子机理。方法：选取2011年9月-2013年2月于我院就诊的门诊患者,以64排螺旋CT检查和急性冠脉综合征的临床症状入选非钙化斑块、钙化斑块患者及正常对照组。受试者于清晨空腹采集静脉血5mL,1h内分离血清-80℃冻存。初筛每组入选12例,采用TaqMan法qRT-PCR对斑块不稳定相关的11种niRNA(miR-1,miR-16,miR-21,miR-133a,miR-133b,miR-126,miR-143,miR-145,miR-155,miR-221,miR-222)进行检测；通过相对定量分析,对斑块组较正常组表达差异倍数>1.5倍的niRNA进一步扩大样本量(185例：非钙化斑块61例,钙化斑块62例,正常对照62例)进行验证以寻找在非钙化斑块中差异表达的mniRNA并确定其对非钙化斑块患者的诊断价值。同时ELISA方法检测以上185例患者血清中MMP-2和MMP-9水平,探索目标miRNA和MMP-2和MMP-9血清水平的相关性。在巨噬细胞中过表达目标miRNA,运用Westemblot和RT-PCR方法检测其对靶基因蛋白和mRNA水平的影响及MMP-2和MMP-9表达和分泌的影响。运用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因。运用小RNA干扰技术转染巨噬细胞目标靶基因后进一步观察目标miRNA对MMP-2和MMP-9的影响。用SPSS17.0进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：初筛结果显示,和动脉粥样硬化不稳定斑块相关的11种miRNA中,有6种miRNA(miR-1,miR-16,miR-21,miR-126,miR-155,miR-221,miR-222)在非钙化斑块组/王常对照或钙化斑块/正常对照组血清中差异表达。进一步扩大样本量进行验证结果显示,miR-16,miR-21,miR-126,miR-155和miR-221水平在非钙化斑块组、钙化斑块组和正常对照组中表达存在显著差异,其中血清miR-16和miR-21能够将非钙化斑块组与其余病例进行区分(p<0.01)。而和miR-16及miR-21功能相关的MMP-2和MMP-9水平在非钙化斑块组与钙化斑块组和正常对照组血清之间亦存在显著差异(p<0.01)。miR-16,miR-21,MMP-2和MMP-9四者联合诊断非钙化斑块的ROC曲线下面积可达0.868(95%CI:0.815-0.922,p<0.001)。相关性分析发现血清miR-16和miR-21水平呈显著负相关(r=-0.30,p<0.001),血清miR-16水平和血清MMP-9水平呈显著正相关(r=0.25,p<0.001),血清miR-21水平和血清MMP-9水平呈显著负相关(r=-0.18,p<0.05),而参与动脉粥样硬化的HDL和miR-16存在相关性(r=-0.20,p<0.05)。血清miR-16预测非钙化斑块的OR值为2.397(95%CI:1.193-4.813,p<0.05),血清miR-21预测非钙化斑块的OR值为0.475(95%CI：0.262-0.863,p<0.05)。考虑到巨噬细胞在动脉粥样硬化发生中发挥重要作用,后续机制研究主要在人巨噬细胞模型中进行。我们的研究发现非钙化斑块病人巨噬细胞中miR-16和miR-21水平显著升高。对其作用机制的研究发现过表达miR-16和miR-21可以使人巨噬细胞中MMP-9的表达和分泌增加。荧光素酶报告实验证明RECK是miR-16的一个新靶点。采用特异siRNA抑制RECK呈现和过表达miR-16或miR-21相同生物学效应。而在siRNA干扰掉RECK的水平上过表达miR-16或miR-21,却不能增加人巨噬细胞MMP-9表达。结论：血清miR-16和21水平与冠脉不稳定斑块相关,可能成为早期识别冠脉不稳定斑块的循环标志物。RECK参与miR-16和miR-21诱导的人巨噬细胞的MMP-9表达和分泌,miR-16和miR-21可通过抑制巨噬细胞中的靶基因RECK表达来促进下游MMP-9的表达和分泌,使纤维帽基质降解从而导致斑块不稳定。
【作者】范雪松；
【导师】陈曦；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】循环miRNA；不稳定斑块；基质金属蛋白酶；生物标志物；

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